食品安全涉及對(duì)禁止或*添加的食品添加劑、農(nóng)藥殘留等進(jìn)行分析，食品生產(chǎn)企業(yè)及相 關(guān)檢測(cè)機(jī)構(gòu)均應(yīng)建立長(zhǎng)效的監(jiān)管機(jī)制。面對(duì)大量的分析樣品，亟需建立的分析方案。 常規(guī)的逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案，在方法變更時(shí)需要手動(dòng)更換色譜柱和溶劑，如需夜間 或周末更換方法，就需要安排實(shí)驗(yàn)人員加班值機(jī)，否則儀器待機(jī)將處于空閑狀態(tài)；如果分 析過(guò)程中使用了含鹽等添加劑的流動(dòng)相，儀器待機(jī)期間則無(wú)法進(jìn)行系統(tǒng)的沖洗，對(duì)色譜 柱、管路和液相色譜硬件等都可能會(huì)造成危害。 
?        在 2016 年新版食品安全標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，本文采用全自動(dòng)多方法方案，對(duì) 5 種食品添 加劑[1-5] 和 5 種農(nóng)藥殘留[6-10] 等 10 種分析方法進(jìn)行自動(dòng)序列運(yùn)行。全自動(dòng)多方法方案是基 于色譜柱和溶劑自動(dòng)切換的液相色譜系統(tǒng)解決方案，基于 Agilent 1260 Infinity II 和 1290 Infinity II 液相色譜的全自動(dòng)多方法方案，已用于多種類(lèi)別樣品的分析[11,12]。與傳統(tǒng)的單臺(tái) 儀器逐一運(yùn)行方案相比，全自動(dòng)多方法方案自動(dòng)化程度高，減少了樣品分析時(shí)間和儀器待 機(jī)時(shí)間，提高了分析效率。
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?實(shí)驗(yàn)部分
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?試劑和樣品
?        甲醇、乙腈為色譜純級(jí)，購(gòu)于 Merck 公司；甲酸、乙酸、乙酸銨 為分析純，購(gòu)于 Sigma-Aldrich 公司；實(shí)驗(yàn)用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備的高純水；食品添加劑和農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)品（見(jiàn) 表 1 和表 2）購(gòu)于上海安譜公司。 
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?標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 
?        對(duì)食品添加劑和農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)方 法[1, 2, 4-10] 或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法[3] 進(jìn)行配制。 
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?儀器配置
?基于 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜全自動(dòng)多方法解決方案，典型 的儀器配置如下： 
?– 安捷倫液相色譜全自動(dòng)多方法解決方案（部件號(hào) G219A） 
?– Agilent 1260 Infinity II 四元泵（部件號(hào) G7111B） 
?– Agilent 1260 Infinity II 多重自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) G7167A），配樣 品冷卻裝置（部件號(hào) G7167A #100） 
?– Agilent 1260 Infinity II 柱溫箱（部件號(hào) G7116A），內(nèi)置閥驅(qū)（部 件號(hào) G7116A#058），配 4-位置-10-端口色譜柱選擇閥（部件 號(hào) G4237A）、毛細(xì)管組件（部件號(hào) G4237A#005）、Agilent InfinityLab Quick-Turn 液相色譜接頭（部件號(hào) 5067-5966） 
?– Agilent 1260 Infinity II 二極管陣列檢測(cè)器（部件號(hào) G7117C） 
?– Agilent 1290 Infinity 外置閥驅(qū)（部件號(hào) G1170A），配 12-位置-13- 端口生物惰性溶劑選擇閥（部件號(hào) G423） 
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?基于 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜全自動(dòng)多方法解決方案，典 型的儀器配置如下： 
?– 安捷倫液相色譜全自動(dòng)多方法解決方案（部件號(hào) G219A） 
?– Agilent 1290 Infinity II 四元泵（又稱(chēng)“泵”）（部件號(hào) G7104A） 
?– Agilent 1290 Infinity II 多重自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) G7167B），配樣 品冷卻裝置（部件號(hào) G7167B #100） 
?– Agilent 1290 Infinity II 柱溫箱（部件號(hào) G7116B），內(nèi)置閥驅(qū) （部件號(hào) G7116B#058），配色譜柱識(shí)別標(biāo)簽讀卡器（部件號(hào) G7116B#072）、8-位置-18-端口色譜柱選擇閥（部件號(hào) G4239C）、 毛細(xì)管組件（部件號(hào) G4239C#005）、Agilent InfinityLab QuickConnect 快速連接接頭（部件號(hào) 5067-5957） 
?– Agilent 1290 Infinity II 二極管陣列檢測(cè)器（部件號(hào) G7117B） 
?– Agilent 1290 Infinity 外置閥驅(qū)（部件號(hào) G1170A），配 12-位置-13- 端口生物惰性溶劑選擇閥（部件號(hào) G423）
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?軟件
?        Agilent OpenLAB CDS ChemStation C.01.07 SR3 色譜控制軟件 
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?溶劑及溶劑選擇閥的配置
?        全自動(dòng)多方法方案中如果配置 1 個(gè)溶劑選擇閥，溶劑可從原來(lái) 的 4 種擴(kuò)展至 15 種，如果配置 2 個(gè)溶劑選擇閥，可擴(kuò)展至 25 種溶 劑。本文示例的 10 個(gè)分析方法使用了 6 種溶劑，分別為：甲醇（通 道 B）、乙腈（通道 C）、純水（通道 A 和 D1）、0.5% 的乙酸水溶 液（通道 D2）、20 mmol/L 乙酸銨水溶液（通道 D3）、20 mmol/L 乙酸銨并添加 2 mmol/L 甲酸的水溶液（通道 D4）。在儀器配置 的“通道配置”選項(xiàng)，選擇溶劑選擇閥的接入流路，如 Agilent 1290 Infinity II 泵，選擇 D 通道；在“溶劑”選項(xiàng)，編輯溶劑 信息，如溶劑名稱(chēng)、pH 值、摩爾濃度等，并選擇溶劑類(lèi)型；然后 在儀器分析方法的編輯過(guò)程中，針對(duì)不同的分析方法，即可方便 地選擇樣品分析及系統(tǒng)清洗所需要的溶劑。 
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?色譜柱及色譜柱選擇閥的配置
?        在全自動(dòng)多方法方案中，針對(duì)不同的分析方法，可能會(huì)使用不 同類(lèi)型或規(guī)格尺寸的色譜柱，使用色譜柱選擇閥，可自動(dòng)進(jìn)行 分析方法中色譜柱的選擇與切換。如 8-位置-18-端口色譜柱選 擇閥，可同時(shí)安裝 8 根短柱（柱長(zhǎng) < 100 mm）或 4 根長(zhǎng)柱（柱 長(zhǎng) < 300 mm），或短柱與長(zhǎng)柱的組合（一根長(zhǎng)柱占據(jù)兩根短柱的 位置，如 6 根短柱 + 1 根長(zhǎng)柱，或 4 根短柱 + 2 根長(zhǎng)柱，或 2 根 短柱 + 3 根長(zhǎng)柱）。本文示例的 10 種方法使用了 3 根色譜柱，分 別為：Agilent Poroshell EC-C18, 2.1 x 50 mm, 1.9 µm（柱 1，部件 號(hào) 699675-902），Agilent ZORBAX RRHD, SB-C18, 2.1 x 100 mm, 1.8 µm（柱 2，部件號(hào) 858700-902），Agilent ZORBAX RRHD, SB-Aq, 2.1 x 100 mm, 1.8 µm（柱 3，部件號(hào) 858700-914）。 
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?液相色譜條件
        ?5 種食品添加劑和 5 種農(nóng)藥殘留分析方法中主要的儀器參數(shù)分別 如表 1 和表 2 所示，表中分別列出了自動(dòng)進(jìn)樣器參數(shù)、泵閥組合 參數(shù)、柱溫箱參數(shù)和 DAD 檢測(cè)參數(shù)等。
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?表 1. 食品添加劑分析的主要儀器參數(shù)?

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?表 2. 農(nóng)藥殘留分析的主要儀器參數(shù)?

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?過(guò)渡方法的建立
?        全自動(dòng)多方法方案的關(guān)鍵技術(shù)是實(shí)現(xiàn)多個(gè)方法的自動(dòng)序列運(yùn)行， 不同的分析方法可能會(huì)使用不同的溶劑、色譜柱和分析參數(shù)，如 流速、梯度程序、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)和進(jìn)樣量等。為實(shí)現(xiàn)多個(gè)分析 方法的自動(dòng)切換、無(wú)縫銜接，需要編輯過(guò)渡方法來(lái)進(jìn)行溶劑與色 譜柱的自動(dòng)選擇與切換、系統(tǒng)的自動(dòng)平衡與清洗等。 在過(guò)渡方法中要實(shí)現(xiàn)溶劑置換、系統(tǒng)平衡、清洗和保存等功能， 可借助色譜柱選擇閥中“廢液”或“旁路”的流路設(shè)計(jì)，如圖 1 所示。在“廢液”流路中，溶劑不經(jīng)過(guò)色譜柱和檢測(cè)器；在“旁 路”流路中，溶劑不經(jīng)過(guò)色譜柱但流經(jīng)檢測(cè)器，可根據(jù)需要選擇 適當(dāng)?shù)牧髀穼?shí)現(xiàn)相應(yīng)的功能。如用于不同分析方法的轉(zhuǎn)換，設(shè)置 溶劑組合比例為 50:50，可采用“廢液”的流路快速進(jìn)行溶劑置 換；若用于含鹽溶劑的系統(tǒng)清洗，可采用“廢液”或“旁路”的 流路，并選擇純水高流速快速?zèng)_洗；對(duì)系統(tǒng)或色譜柱的平衡、沖 洗和保存等，可采用色譜柱的流路，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行沖洗， 如在樣品分析之前，使用樣品分析方法所用的起始比例的溶劑平 衡色譜柱，在樣品分析之后，使用純有機(jī)溶劑清洗和保存色譜 柱等。
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?序列的建立與運(yùn)行
?        分別編輯 10 個(gè)分析方法每類(lèi)樣品的序列文件，根據(jù)需要設(shè)置合適 的樣品類(lèi)型，如標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)校正樣品、質(zhì)控樣品和未知樣品等，并 采用樣品分析方法如 SAMPLE ANALYSIS.M。以方法 1 為例，在 樣品分析之前插入如 SYSTEM PRERUN.M 的過(guò)渡方法，用于溶劑 置換和系統(tǒng)平衡，在樣品分析之后插入如 SYSTEM POSTRUN.M 的過(guò)渡方法，用于系統(tǒng)清洗和保存，如表 3 所示。 
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?表 3. 序列文件中序列表的編輯?

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?        按照同樣的方法分別編輯其它類(lèi)樣品分析的序列文件。在序列 隊(duì)列運(yùn)行中依次添加上述多個(gè)樣品分析的序列文件，如 M1.S、 M2.S，……，并在運(yùn)行隊(duì)列的后一行添加一個(gè)關(guān)機(jī)（待機(jī)）的 序列文件，如 SYSTEM SHUTDOWN.S，多方法序列運(yùn)行之后， 將儀器設(shè)置為待機(jī)狀態(tài)，如自動(dòng)關(guān)閉所用燈、泵和柱溫箱等。
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?結(jié)果與討論 
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?分析結(jié)果
?        按照上述方法進(jìn)行儀器配置、樣品分析方法的建立、過(guò)渡方法的 建立、序列文件的建立、序列隊(duì)列的建立和運(yùn)行等，所得方法 1-10 典型的色譜圖如圖 2 和圖 3 所示。

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?全自動(dòng)多方法方案與逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案的比較 
?        使用小粒徑填料的色譜柱，可以提高柱效，但也會(huì)增大柱壓。 Agilent ZORBAX RRHD 粒徑 1.8 μm 填料的系列色譜柱，高耐 壓 1200 bar；Agilent Poroshell 粒徑 1.9 μm 填料的系列色譜柱， 高耐壓 1300 bar。基于 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜全自動(dòng) 多方法方案，系統(tǒng)耐壓 1300 bar，滿(mǎn)足小粒徑填料色譜柱快速高 效的分析需求。以方法 9 為例，在唑螨酯的測(cè)定中，標(biāo)準(zhǔn)方 法 GB 23200.29 使用 C18, 4.6 X 250 mm, 5 μm 的色譜柱，在推 薦的色譜分離條件下，唑螨酯的保留因子 k 約為 2.16；在本文所 述的全自動(dòng)多方法方案中，使用 Poroshell EC-C18, 2.1 X 50 mm, 1.9 μm 的色譜柱，唑螨酯的保留因子 k 為 5.8。與標(biāo)準(zhǔn)方法 相比，全自動(dòng)多方法方案不僅保留因子增大，而且分析時(shí)間顯著 減少。?
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?        以本文示例的 10 種分析方法為例，不考慮樣品前處理等，采用單臺(tái)儀器逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案，對(duì)每個(gè)方法樣品分析前后系統(tǒng)準(zhǔn)備 的時(shí)間預(yù)估為 1.5 h，如更換溶劑、平衡色譜柱、清洗色譜柱等；而采用全自動(dòng)多方法方案，每個(gè)方法所使用的過(guò)渡方法時(shí)間預(yù)估為 0.5-1 h。分別采用逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案和全自動(dòng)多方法方案運(yùn)行食品添加劑和農(nóng)藥殘留等 10 種分析方法，若每個(gè)方法進(jìn)樣 40 針，兩種 方案中每個(gè)方法的總運(yùn)行時(shí)間如表 4 所示。 
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?表 4. 采用逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案與全自動(dòng)多方法方案分別運(yùn)行 10 種分析方法的所需時(shí)間（單位：h）?

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?        在正常的周工作時(shí)間，若采用逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案，按照方法 1 至方法 10 的順序依次運(yùn)行，僅考慮樣品的儀器運(yùn)行時(shí)間，需要 9 天，如表 5 所示。該方案在分析方法變更時(shí)，需要手動(dòng)更換色譜柱、溶劑等；有時(shí)候還需要值機(jī)，比如在第 9 天，先運(yùn)行方法 8，需要 等待方法 8 運(yùn)行結(jié)束，更換色譜柱之后才能運(yùn)行方法 9 和 10。若采用全自動(dòng)多方法方案，可自動(dòng)連續(xù)序列運(yùn)行上述 10 種分析方法，實(shí)現(xiàn) 儀器 100% 的利用率；在全自動(dòng)多方法方案運(yùn)行過(guò)程中，無(wú)需手動(dòng)更換色譜柱和溶劑，可實(shí)現(xiàn)無(wú)人值守。與逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案相 比，全自動(dòng)多方法方案還能減少儀器在夜間或周末的待機(jī)時(shí)間，總分析時(shí)間由 9 天減少至 2 天，分析效率大大提高。 
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?表 5. 逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案與全自動(dòng)多方法方案的比較?

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        ?對(duì)不同的樣品分析方法，有些方法可能會(huì)使用含酸、堿或鹽等添 加劑的流動(dòng)相，如本文示例方法 2、3、4、5、6 和 8，這幾個(gè)方 法在流動(dòng)相中添加乙酸或乙酸鹽等，用于改善分離。在常規(guī)液相 色譜系統(tǒng)中，樣品分析之后需要手動(dòng)更換溶劑，并進(jìn)行色譜柱和 系統(tǒng)的沖洗。手動(dòng)操作不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在夜間或周末就無(wú)法 進(jìn)行系統(tǒng)的沖洗。比如，使用常規(guī)系統(tǒng)按照逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方 法方案依次運(yùn)行上述 10 種分析方法，在第 4 天運(yùn)行方法 4，需要 15.5 h；若從上午 9 點(diǎn)開(kāi)始，運(yùn)行至凌晨結(jié)束，樣品分析結(jié)束的 時(shí)間為夜間，液相色譜系統(tǒng)將保存在含鹽流動(dòng)相體系中，這對(duì)色 譜柱、管路和液相色譜硬件都會(huì)造成潛在的危害。 
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?        常規(guī)液相色譜一般配置 4 個(gè)溶劑通道，對(duì)四元泵，如 Agilent 1290 Infinity II 泵，配置 A、B、C、D 四路溶劑；對(duì)二元泵， 如 Agilent 1290 Infinity II 高速泵，配置 A1/A2、B1/B2 四路溶 劑。在逐一運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)方法方案中，對(duì)使用含添加劑流動(dòng)相的 分析方法，運(yùn)行結(jié)束后調(diào)用通道 A 的純水，可沖洗系統(tǒng)中混合器 之后的管路及配件；對(duì)全自動(dòng)多方法方案，調(diào)用溶劑選擇閥擴(kuò)展 流路中的純水，如通道 D1 的純水，可實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的*清洗。以 方法 4 為例，該方法水相為含鹽溶劑（配置在通道 D4），樣品 分析之后，在過(guò)渡方法中調(diào)用溶劑選擇閥通道 D1 的純水，并采 用“廢液”或“旁路”的流路沖洗整個(gè)系統(tǒng)，系統(tǒng)沖洗完成后再 切換色譜柱選擇閥至色譜柱流路位置，先使用較高比例的純水沖 洗色譜柱中殘留的含鹽溶劑，再使用純有機(jī)溶劑對(duì)色譜柱進(jìn)行清 洗和保存。與常規(guī)的液相色譜系統(tǒng)清洗方法相比，采用全自動(dòng)多 方法方案的系統(tǒng)清洗方法，除了可以沖洗系統(tǒng)混合器后的管路及 配件，還可以對(duì)溶劑選擇閥和混合器之間的管路以及該流路脫氣 機(jī)內(nèi)腔進(jìn)行*清洗，如圖 4 所示，全自動(dòng)多方法方案能自動(dòng)進(jìn) 行溶劑置換和系統(tǒng)清洗，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的無(wú)鹽保存。?

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?全自動(dòng)多方法方案的重現(xiàn)性 
?        以方法 1 和方法 2 連續(xù) 3 個(gè)批次的自動(dòng)序列運(yùn)行為例，每個(gè)樣品 重復(fù)進(jìn)樣 10 次，考察全自動(dòng)多方法方案批內(nèi)及批間的重現(xiàn)性。方 法 1 和方法 2 使用*不同的流動(dòng)相體系，并采用等度方法進(jìn)行分 析。以方法 2 為例，通過(guò)連續(xù) 3 個(gè)批次的序列運(yùn)行，對(duì)糖精鈉、 苯甲酸和山梨酸，批內(nèi)及批間保留時(shí)間的精密度均小于 0.2%， 批內(nèi)及批間峰面積的精密度均小于 0.3%，如圖 5 所示，說(shuō)明全自 動(dòng)多方法方案具有良好的分析重現(xiàn)性。采用全自動(dòng)多方法方案進(jìn) 行批次運(yùn)行，對(duì)每個(gè)分析方法，批次運(yùn)行前后均采用統(tǒng)一的系統(tǒng) 平衡與沖洗的方法（不同方法之間可能有差異），既提高了分析 重現(xiàn)性，也有利于批次間數(shù)據(jù)的比對(duì)。?
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?結(jié)論 
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?        隨著食品安全監(jiān)管的加強(qiáng)，食品中*添加的食品添加劑和農(nóng)藥 殘留的檢測(cè)任務(wù)日益增多，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于提高自動(dòng)化程度、提 高儀器使用效率和分析產(chǎn)出效率的要求也日益強(qiáng)烈。安捷倫液相 色譜全自動(dòng)多方法解決方案在液相色譜標(biāo)準(zhǔn)模塊的基礎(chǔ)上，增配 溶劑選擇閥和色譜柱選擇閥，為實(shí)現(xiàn)多方法的全自動(dòng)序列運(yùn)行提 供了便利。全自動(dòng)多方法方案運(yùn)行期間無(wú)需手動(dòng)更換溶劑和色譜 柱，能夠?qū)崿F(xiàn)無(wú)人干預(yù)和無(wú)人值守，解放了勞動(dòng)力。多個(gè)方法 自動(dòng)序列運(yùn)行，可充分利用夜間、周末等時(shí)間，減少儀器待機(jī) 時(shí)間，從而提高儀器使用效率。同時(shí)，使用 Agilent Poroshell 和 ZORBAX RRHD 系列小粒徑填料的色譜柱，能在滿(mǎn)足分離要求的 基礎(chǔ)上顯著減少分析時(shí)間；全自動(dòng)多方法方案中使用的溶劑 置換和系統(tǒng)清洗的方法，可使系統(tǒng)得到*清洗，實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的無(wú) 鹽保存，在批次運(yùn)行中也有利于提高批內(nèi)及批間的分析重復(fù)性。 除本文示例所述的食品添加劑和農(nóng)藥殘留的分析方法之外，全自 動(dòng)多方法方案還可以組合其他類(lèi)型樣品的分析方法，用于不同行 業(yè)和領(lǐng)域，如食品安全監(jiān)管、藥物質(zhì)量控制和環(huán)境檢測(cè)等，提高 實(shí)驗(yàn)效率。?
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?參考文獻(xiàn) 
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